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澳门百家乐玩法 > 工程技术论文 > 一般工业技术 > 海洋放线菌酰胺酶AM合成基因的克隆

海洋放线菌酰胺酶AM合成基因的克隆

2018-07-27 13:58:00 字体:   打印 收藏 

摘 要:克隆稀有海洋放线菌酰胺酶AM合成基因的基因片段。根据Salinispora arenicola CNS-205的核苷酸序列保守区设计两对酰胺酶特异性引物,以其总DNA为模板,采用PCR的方法扩增得到了包含酰胺酶AM的完整的基因片段,并将该片段成功插入到克隆载体pUC-18中。将重组质粒进行酶切验证,并在检测机构中验证测序结果正确。,成功地获得了稀有海洋放线菌Salinispora arenicola的酰胺酶AM合成基因的基因片段。

关键词:海洋放线菌;NdeI;EcoRI;酰胺酶;腈水解酶超家族

 放线菌与人类的生产和生活息息相关,是很多天然药物和生物活性物质的重要来源[1]。海洋放线菌产生了许多具有特殊化学结构,以及特殊生理活性和生理功能的物质[2]。尽管海洋放线菌的类群和数量都非常可观,但很多研究者使用经典的分离培养方法培养却失败了 [3]。近年来,从海洋放线菌中陆续发现的SalinosporamideA等一系列新的活性化合物,均可证明海洋是一个具有极大地潜力的资源宝库[4-7]。  因此,本研究旨在以稀有海洋放线菌Salinispora arenicola CNS-205为实验材料,克隆出海洋放线菌酰胺酶AM的完整基因。,以为该基因簇的功能研究奠定基础。   1 试验材料与方法   1.1 试验材料   1.1.1 菌种来源   海洋放线菌Salinispora CNS-205分子生物学实验室保存为本实验室保存。   1.1.2 主要试剂   大肠杆菌DH10B; 限制性内切酶NdeI和EcoRI;DNA分子标准量marker;DNA聚合酶。 DNA 提取试剂盒,T4DNA 连接酶,凝胶回收试剂盒,质粒小提试剂盒等,均购买自天根生化科技(北京)有限公司;其余均为国产分析纯试剂。   1.2 试验方法   1.2.1 重组质粒的构建   PCR反应体系:H2O 28.5 微升μL,5*FAST HiFidelity PCR Buffer 10 微升μL,20* FAST PCR Enhancer 2.5 微升μ L,DMSO 2 微升μL,Template 2 微升μL,PrimerL 2 微升μL,PrimerR 2 微升μL,FAST HiFidelity polymerase 1 微升μL。PCR程序:升温90 ℃,2 min;DNA变性 95 ℃,30 s;退火53 ℃,30 s;引物延伸72 ℃,2 min;30周期后,72 ℃维持10 min,电泳。PCR产物的片段为双链平末端,需通过酶切的方式将粘性末端黏性末端暴露出来。酶切反应体系如下(50 mL反应体系):   水 11 mL   EcoRI Buffer 5 mL   PCR回收样品 30 mL   EcoRI 2 mL   NdeI 2 mL   然后放入37 ℃水浴锅中水浴2小时 h,经胶回收后的PCR产物连入pUC-18载体。   酶连体系(20 mL反应体系):   灭菌水 6 mL   PCR样品回收片段 10 mL   PpUC-18回收片段 1 mL   10*T4 DNA Ligase Buffer 2 mL   T4 DNA Ligase 1 mL   1.2.4 酶切验证   用EcoRI和NdeI酶切,酶切反应体系如下(10 mL反应体系):   水 6.2 mL   EcoRI Buffer 1 mL   抽提的质粒样品 2 mL   EcoRI 0.4 mL   NdeI 0.4 mL   2 试验结果与分析   2.1 目的基因的PCR扩增   以海洋放线菌总DNA为模板, ,用上述引物进行扩增,再EcoRI 和NdeI 酶切回收。原PCR产物的目的条带应位于大约1 800 bp处。,如图1所示。   图1 1 PCR电泳图   2.2 重组质粒的验证   图2中第一个条带约在约2 700 bp左右,为载体的酶切条带;第二个条带位于1 800 bp左右,为目的基因的酶切条带。得出该重组质粒后,测序委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。结果如下图2所示:   图2 2 酶切验证图   3 讨论   酰胺酶的酰基转移活性能催化底物生成其相对应的异羟肟酸,异羟肟酸可作为食品添加剂、生长因子、抗白血病、抗肺结核病、肿瘤抑制因子等药物,是极为重要的可用于化学治疗的物质,具有重要的生物学活性。其金属离子的螯合作用还可以为微生物所吸收利用,在金属离子匮乏的环境中具有重要的意义 [8]。   参考文献:   [1]W Fenical,PR Jensen. Developing a new resource for drug discovery: marine actinomycete bacteria[J].Nature Chemical Biology,2006,2(12):666-673.   [2]侯艳华.四株海洋放线菌遗传转化体系的研究[D].青岛:中国科学院研究生院,2006.   [3]田 新,朋张偲,李文均.海洋放线菌研究进展[J].微生物学报,2011,51(2):161-169.   [4]马艳玲.海洋放线菌基因组文库的构建和功能基因的克隆及序列分析[D].武汉:华中师范大学,2011.   [5]B Bister,D Bischoff,M Ströbele,etal. Abyssomicin C-A polycyclic antibiotic from a marine Verrucosispora strain as an inhibitor of the paminobenzoic acid / tetrahydrofolate biosynthesis pathway[J].Angewandte Chemie International Edition,2004,43(19):2574-2576.   [6]HC Kwon,CA Kauffman,PR Jensen,etal. Marinomycins A-D, antitumor-antibiotics of a new structure class from a marine actinomycete of the recently discovered genus "Marinispora"[J].ChemInform,2006,128(24):16410.   [7]宋亚鹏.丙烯酰胺神经毒性机制研究进程[J].畜牧兽医杂志,201

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名称:现代食品

主办:中粮工程科技(郑州)有限公司

期刊简介:

《现代食品》杂志是经国家新闻出版总署正式批准办刊的国家级刊物,由中粮工程科技有限公司主管,中粮工程科技(郑州)有限公司主办,并由现代食品杂志社编辑出版的综合性食品方面的学术性期刊。国内统一刊号:CN 41-1434/TS,全国公开发行。更多>>

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